Jean Joseph Pasteur, többgenerációs tímárcsalád sarja őrmesterként szolgált Napóleon seregében. Miután szeretett császára Szent Ilona szigetére került, hadseregét pedig szélnek eresztették, továbbvitte az atyai ipart, tímárként rendezkedett be. Feleségül vette egy dolgos kertészcsalád lányát, akivel Arbois városában találnak otthonra. Itt növekedett a kis Louis három lánytestvérével a cserzőmedencék és kifeszített állatbőrök között. Nem volt éppen kiemelkedő tanuló, leginkább a rajzolásban talált örömet. Tizenhárom évesen élethű portrékat készített városa lakóiról, saját szüleit is ő örökítette meg az utókor számára. Tűrhető eredménnyel elvégezte az elemi iskolát, majd gimnáziumba került. A család egy barátja hívta fel a figyelmet arra, hogy a fiú látszólagos közönye feszült figyelmet takar. Amikor Louis elmerült valamiben – legyen az egy könyv vagy egy festmény – megszűnt számára minden. A barát ezért azt javasolta az apának, küldje a fiát Párizsba gimnáziumba.
A tizenhat éves Pasteur felkerült tehát a fővárosba, és megkezdte tanulmányait. Szállásadójának azonban feltűnt, hogy a fiú mélabús, étvágya sincs. Hazaüzent az apjának, aki eljött a honvágytól szenvedő fiúért, és szemrehányás nélkül hazavitte. Végül Pasteur az Arbois-hoz közelebbi Besançon középiskolájában érettségizett. Bár eredményei itt is vegyesek voltak, meghívták tanítónak. El is kezdett tanítani, de ekkor már a párizsi elitegyetem, az École Normale felvételi vizsgájára készült. Második próbálkozásra bekerült az intézménybe, ahol olyan tudósok oktatták, mint Gay-Lussac, vagy a fény sebességét leíró Fizeau.
Az államvizsgájára készült, amikor foglalkoztatni kezdte a borkősav. Pasteur egyetemi éveinek idejére már évtizedes probléma volt, hogy két teljesen egyforma vegyület közül az egyik eltéríti a polarizált fényt, a másik nem. Egy időre viszont szüneteltetnie kellett az ezen való agyalást. Előbb ledoktorált kémiából és fizikából (közepes eredménnyel), majd eljött 1848 februárja, amikor a párizsi munkásság és értelmiség fellázadt a Bourbon-ház ellen. Az öreg Pasteur arra nevelte fiát, hogy a jövőt a köztársasági államformában lássa, ezért maga dr. Louis Pasteur is fegyvert ragadott, a köztársaság kikiáltásának idején nemzeti gárdistaként teljesített szolgálatot. Bár magától nem hagyta volna el Párizst, hazautazott anyja betegségének hírére, de már csak a temetésen tudott részt venni. Hónapokig Arbois-ban gyászolt, s akkor tért vissza a fővárosba, amikor már felhagytak a forradalmárok üldözésével. Újra kézbe vette a borkősavas kémcsöveit, és rájött, hogy a két vegyület (a szőlősav és a borkősav) bár minden tulajdonságát tekintve ugyanolyan, térben egymás tükörképei, emiatt viselkednek másképp a fény útjában. Ezzel megteremtette a sztereokémia alapjait.